28 辅助生殖技术在野生猫科动物中的应用

引言

在过去1000万年的地球历史中，野生猫科动物进化为极为成功的类群。如今，38个已知物种分布于五大洲，在各自生态位中处于顶级捕食者地位。不过，在过去10000年里，尽管猫科动物未出现物种灭绝，但因人口增长、资源过度消耗、栖息地破坏和气候变化，大多数现存野猫物种生存面临严重威胁，几乎所有非家养野生猫科动物数量都在下降。在国际自然保护联盟红色名录（IUCN,2020）中，25个物种被列为不同程度濒危（极度濒危至接近灭绝），许多IUCN评估过及更多未评估的亚种濒临灭绝 。

为应对生物多样性丧失，近600家获美国动物园和水族馆联合会（AZA）、欧洲动物园和水族馆联合会（EAZA）认可的动物园，联合制订合作繁殖计划，以保证濒危猫科动物种群数量。欧洲物种保护协会的物种生存计划（SSP）和欧洲濒危物种保护协会的欧洲濒危物种计划（EEPs），利用血统书的谱系数据记录和遗传分析制订繁殖计划，力求使种群数量和基因多样性最大化。目前，欧洲物种保护协会监管14种特殊猫科动物的保护措施，欧洲濒危物种保护协会监管13种，其中11种由两者共同管理。仅依靠传统管理方案中的自然繁殖，绝大多数（75%）动物园的猫数量甚至无法维持100年。动物园管理种群数量减少，会使某些物种至关重要的安全网消失，剥夺科学家宝贵研究资源。

确保人类管理计划下野生猫科动物种群数量长期维持困难重重，不过，更广泛应用包括辅助生殖技术在内的生殖科学技术，有望显著改善这一局面。对野生猫科动物而言，动物园内优先采用的生殖技术有精液采集和分析、体外授精、胚胎移植、人工授精以及精子和胚胎冷冻保存。此外，体细胞核移植或从诱导多能干细胞中创造精子和卵母细胞等更先进生殖技术，虽常因保护潜力被推广，但对野生动物的应用效益多年后才会显现，野生猫科动物缺乏等待这些新兴技术的时间来解决迫切的物种保护需求。动物园内猫科动物物种延续，最终取决于能否产生足够存活后代，以抵消因衰老、受伤和疾病导致的死亡，而这受有限物理空间、低遗传多样性及财政资源限制。若希望辅助生殖技术对维持猫科动物数量发挥有意义作用，未来10 – 20年内，其成熟度和对种群管理的适用性必须大幅提高，时间成为应用辅助生殖技术的关键影响因素。

野生猫科动物辅助生殖技术的成功应用，最初依赖在家猫中的初步研究。家猫约在1万年前由野猫驯化而来，与野猫在生理和遗传上有诸多相似。对猫科动物繁殖的基本认识多源于家猫实验研究，目前在野生猫科动物中成功使用的所有辅助生殖技术，都是首先在家猫驯化群体中开发、完善和应用的。反之，动物园中的野生猫科动物种群，为科学家研究这些技术的跨物种应用提供了重要资源。应用辅助生殖技术的先决条件，是识别物种特异性繁殖性状，通过精液采集和分析确定物种特有的生殖特征，识别不同物种间的相似性与差异性，最重要的是通过粪便激素分析进行无创内分泌监测。尽管野生猫科动物和家猫在进化上有明显差异，但也存在生殖共性，因此辅助生殖技术作为野生猫科动物种群管理策略，正受到更多关注。

表 28.1 野生猫科动物保护现状和种群管理计划

注：a国际自然保护联盟红色名录物种级别分类：EN，濒危；VU，脆弱；NT，濒临灭绝；LC，无危。bAZA，美国动物园和水族馆联合会；SSP，物种生存计划。c EAZA，欧洲动物园和水族馆联合会；EEP，欧洲濒危物种计划。

精液采集、分析和冷冻保存

精液采集对评估雄性基本生殖性状，获取精液用于冷冻保存、体外授精和人工授精十分关键。多种采集方法对猫科动物安全有效。对于野生猫科动物，麻醉雄性的电刺激射精应用最广泛，过去40年，几乎所有动物园饲养的野生猫科物种都用此方法成功采集精液。电射精技术是将润滑的直肠探头插入直肠，探头有纵向或圆周电极，直径根据猫体型调整，连接电刺激器，通过一系列可控低电压（2 – 6V）刺激诱发射精，通常2 – 3组，每组20 – 30个刺激，用保温无菌塑料杯在阴茎头回收射精样本。另一种替代方法是用插入尿道（到前列腺深度）的开放式导尿管回收高浓度精液，雌性需用α2激动剂麻醉，诱导精子从输精管释放到远端尿道，导管直径和插入深度依物种体型而异。不同物种和个体中，导尿管与电射精的总精子回收率基本相同，已从狮子等至少10种野生猫科动物中回收到高质量样本。少数情况下，非麻醉野生猫科动物（如猎豹、老虎）若经驯养员严格驯养，可用人工阴道采集精液。大多数猫死后，可冲洗输精管和附睾尾部回收精液，若死后组织低温储存运输，24h内可获存活精液样本。

全面精液分析可深入了解猫生育力，确定不同品种猫的标准精液参数。精液回收后，常用适用于其他哺乳动物的标准显微观察方法，评估猫精液样本的体积、精液pH、精子浓度、运动能力、运动速度和精子形态等基本特征。个体间精液性状差异大，物种间精子数量和形态特征往往有一致差异。一般小型猫科动物每次射精精子少于大型猫科动物，限制了小型猫科动物精子冷冻或人工授精。某些物种（如猎豹和云豹）精子形态差，被归类为畸形精子症，影响精子功能和冷冻敏感性，降低辅助生殖成功率，而有些物种（如豹猫和老虎）精子形态正常率较高，多数物种介于两者之间。

野生猫科动物生殖研究常涉及多地动物园合作，距离限制复杂实验设备运输，因此需要“移动式实验室”，研究人员倾向使用紧凑、轻便、耐用设备，这影响研究设计，如野猫精子运动特性研究常采用主观评估，避免使用繁琐的计算机辅助精子分析系统。其他精子性状，如顶体状态、活力、获能状态和线粒体功能，可通过固定样本的特殊比色法或荧光染色评估。对野猫更深入的精子品质分析，还包括精子代谢、染色质断裂和精子功能。猫科动物配子水平无跨物种生殖障碍，野生猫科动物精子可在体外穿透家猫卵母细胞使其受精，家猫卵巢卵母细胞易收集和成熟培养，消除了利用野猫同源卵母细胞研究精子功能的困难。异源体外受精可评估单个雄性生育能力，更常用于冷冻精液精子功能比较评估研究。

精液冷冻保存是辅助生殖技术用于濒危物种保护的基础。冷冻保存的猫科动物精子是宝贵资源，可保存和维持受保护种群遗传多样性，增加动物园有效保存猫品种数量，还能建立不同动物园、国家及原栖息地和迁移地之间的基因流动，代替运输活体猫。但猫精液样本处理和冷冻需保障精子生存能力和功能，才能通过体外受精或人工授精产生后代。尽管研究多年，猫精子仍难以有效冷冻保存。

早期家猫精子在含甘油的卵黄稀释冷冻液中稀释，冰箱短期冷却后在干冰上快速结晶冷冻，应用于野生猫科动物可使解冻后部分精子恢复活力，但精子寿命缩短，仅产生少数后代。多年来，精液冷冻技术不断改进，包括改变稀释剂、冷冻保护剂、冷却速率、包装方法和解冻速度。目前许多野生猫科动物精液样本仍用市售含甘油卵黄稀释液冷冻，方法发展为缓慢冷却后，将冻存管置于液氮蒸汽上或干燥冷冻箱中逐步冷冻保存。

近期研究表明，用大豆卵磷脂冻存剂（含甘油）冷冻家猫和野生猫科动物精子有优势，可减少批次间差异、传染病问题及相关监管限制。对多种野生猫科动物研究发现，大豆卵磷脂冷冻液与卵黄冷冻液冻存的精子解冻后运动能力和功能相似。将猫精子混合于含蔗糖而非甘油的大豆卵磷脂冷冻液中直接快速冷冻到液氮中，通过人工授精获得存活幼崽，证明该方法可行，与导尿管结合用于精液采集，提供了快速方便的精液储存方法，动物园兽医或野生动物学家可就地采集储存精液。然而，尽管猫精液冷冻保存方法有改进，许多野生猫科动物解冻后精液品质仍不适用于辅助生殖，这是将常规精液库和标准授精技术纳入物种保护计划的主要障碍。

人工授精

人工授精是让野生猫科动物产生后代最直接的方法，被推广为与野生动物管理最相关的辅助生殖技术，可实现繁殖行为或生理不统一的野生猫科动物繁育，促成不同动物园的猫以及家猫和野猫之间的杂交繁衍。50多年前，人工授精首次应用于家猫，如今主要通过采集的新鲜精液和解冻精液进行繁殖。过去40年，野生猫科动物阴道和子宫颈人工授精效果不佳，妊娠数量少，可能是麻醉药干扰雌性生殖道对精子的运输。近期尝试的子宫颈人工授精，使狮子、金猫、波斯豹在自然发情期诱导排卵后多次妊娠，但该方法需较高精子数量受孕，且依赖自然发情周期，难适应不同机构物种管理。

腹腔镜技术应用于家猫生殖研究，极大推动了猫科动物人工授精发展。20世纪80年代后期开发的子宫腹腔镜人工授精技术（LU – AI），提高了用外源促性腺激素（eCG，hCG）处理的家猫受孕率，并应用于野生猫科动物，已使8种动物实现妊娠。使用该方法，雌性动物通常只需注射一次eCG诱导卵泡生长，3 – 4天后注射人绒毛膜促性激素（hCG）诱导排卵，注射hCG后36 – 45h进行人工授精。不同物种促性腺激素剂量和人工授精时机需调整，大型猫注射hCG后排卵时间更长，卵巢对eCG/hCG剂量敏感性因物种而异，与体重关系不大。利用猎豹和豹猫的冻融精子进行子宫腹腔镜人工授精，已实现多次妊娠，但该方法在其他物种中成功率有限，部分原因是需相对稳定精子数量受孕，且精子冷冻可能严重影响受孕。

近期，家猫和野生猫科动物标准腹腔镜人工授精方案有多种改进，包括外源性促性腺激素处理方案、授精部位和卵巢功能调控等。eCG和hCG虽能有效诱导卵巢活动和排卵，但hCG刺激排卵后的持续作用会导致卵泡生长和内分泌紊乱，影响胚胎迁移和胎儿发育。用猪促黄体素（pLH）替代hCG，可产生相同诱导排卵效果，且不会持续刺激卵巢。授精首选部位从子宫转移到输卵管，将精子直接注入母猫输卵管壶腹部，可大大减少人工授精所需精子量。目前，输卵管腹腔镜人工授精（LO – AIs）常用于射精精子数量仅200万至400万个的物种。过去人工授精的外源性促性腺激素处理不考虑受体雌性动物自身卵巢发育活动，导致许多个体卵巢反应不一致。现在的输卵管腹腔镜人工授精方案，母猫通常在促性腺激素处理前，每天饲喂低剂量孕酮（烯丙孕素）30 – 55d抑制卵巢发育活动，停用孕酮5 – 7d后，注射eCG和pLH，相应处理时间后通过输卵管腹腔镜技术进行人工授精。采用该方法，70% – 80%的家猫能够受孕，6种野生猫科动物也成功产生后代，豹猫使用新鲜精液和冷冻精液人工授精多次受孕。对豹猫使用随机挑选的冷冻精液进行输卵管腹腔镜人工授精，成功产下多窝幼崽，提高了种群保护计划所需物种数量和遗传多样性。在美国动物园和水族馆联合会管理的14个种群保护计划中，豹猫种群保护因辅助生殖技术成效显著，成为将输卵管腹腔镜人工授精技术应用于其他猫科动物管理计划的潜在模型。

表 28.2 野生猫科动物成功进行人工授精和胚胎移植情况

注：a授精方法：V，阴道授精；TC，经宫颈授精；SU，外科法子宫授精；LU，子宫腹腔镜人工授精；LO，输卵管腹腔镜人工授精。b精液状态：F，新鲜；FT，冻融。c胚胎来源：IVF，体外受精获得。d移植方法：SU，手术法子宫内移植；SO，手术法输卵管内移植；LO，腹腔镜法输卵管内；i，种间移植。e胚胎状态：F，新鲜；FT，冻融。

体外受精、胚胎培养和冷冻保存

家猫体外受精实验为研究猫科动物生殖功能、促性腺激素诱导卵泡发生、卵母细胞成熟、精子获能、配子相互作用、胚胎发育动力学和培养要求提供重要信息，也为研究胚胎移植在物种保护中的潜在用途提供机会，克服自然繁殖或人工授精后体内发育胚胎易死亡的缺点，增加每只雌性动物可产生胎儿数量。与人工授精一样，外源性促性腺激素处理是体外受精技术发展的核心因素。在家猫和野生猫科动物中，eCG或pFSH用于诱导卵巢上更多卵泡生长，抽吸前用pLH或hCG诱导卵泡成熟。通过腹腔镜观察，排卵在pLH或hCG处理后约24 – 27h进行，大多数卵母细胞收集后1 – 2h内完成核成熟（至减数分裂II期）。家猫体外受精的卵巢刺激方案在多数野生猫科动物中有效，不同物种需调整促性腺激素使用剂量。猫科动物精子能在多数补充蛋白的培养液中获能，近20种野生猫科动物体外受精率达中高等水平。体外受精所需精子数量比输卵管腹腔镜人工输精少得多，即使使用冷冻 – 解冻精子，通常也能达到一定受精率。

体外受精研究推动了胚胎培养研究，可比较体外胚胎和体内胚胎发育动力学，对体外受精产生的胚胎发育进行跨物种评估。通过多因素研究培养液配方和阶段特异性代谢需求，改进后的家猫胚胎培养系统可在正常生理发育时间范围内产生更一致的囊胚。培养到子宫期的胚胎能被子宫识别并着床，简化胚胎移植过程，但移植研究表明，延长胚胎培养时间可能对胚胎活力产生不利影响。最后，体外受精技术使早期（2 – 8 – 细胞）和晚期（桑椹胚／囊胚）胚胎冷冻保存成为可能。对其他哺乳动物使用的缓慢梯度冷冻和玻璃化冷冻胚胎冷冻保存方法，在家猫及一些野生猫科动物中也适用。与精子冷冻和人工授精一样，可靠的胚胎冷冻方法是未来将胚胎移植应用于野生猫科动物保护管理的先决条件。

胚胎移植

从应用角度看，体外受精的价值在于产生可移植且有发育成后代潜能的野生猫科动物胚胎。与人工授精相比，胚胎移植更复杂，需单独腹腔镜手术回收和转移卵母细胞，且通常需要进行胚胎冷冻保存，以确保受体在相同生理状态下再进行移植。然而，无论是通过卵母细胞回收/体外受精程序进行常规处理，还是在出现意外死亡后进行卵母细胞体外成熟或体外受精以挽救基因损失，胚胎移植确实为保证母猫的遗传潜力提供了一种更直接的手段。 家猫的早期胚胎移植研究证明，从体内获得的胚胎移植入子宫后能够生产后代 。十多年来，体外受精胚胎的胚胎移植一直是野生猫科动物胚胎移植的主要方法，老虎、野猫、渔猫、家猫、山猫这5个物种都实现了胚胎移植后的妊娠，野猫和家猫利用冷冻胚胎移植后也成功妊娠 。然而，随着越来越多地使用腹腔镜取卵技术和人工授精技术，以及选择早期体外受精胚胎的输卵管移植，输卵管腹腔镜胚胎移植（LO – ET）技术在家猫繁殖中也得到应用和发展，以取代剖腹移植手术 。对野生猫科动物的比较研究表明，LO – ET具有跨物种的作用，对虎猫、沙猫、黑足猫、猎豹这4个物种的体外受精胚胎进行移植都实现了妊娠并产生了后代，其中包括5只山猫利用冷冻胚胎移植后也成功妊娠 。然而目前，体外受精和胚胎移植在任何野生猫科动物的物种保护中都还没有发挥出非常重大的作用。 尽管早期胚胎的输卵管腹腔镜胚胎移植在一些野生猫科动物中已被证实是可行的，但如果要提高应用价值，胚胎培养系统和受孕母体同期发情方法仍需进一步探索。目前的难点在于还无法解决胚胎培养（尤其是长期培养）对胚胎活力的影响、外源性促性腺激素处理引起的输卵管、子宫环境异常对胚胎发育的影响。在这些问题得到解决之前，可能很难从输卵管腹腔镜胚胎移植方法过渡到将胚胎经宫颈移植的微创方法，从而使体外受精/胚胎移植技术作为输卵管腹腔镜人工授精技术的一种替代方法并在物种保护方面得到广泛应用。