27 家猫的辅助生殖技术

引言

辅助生殖技术涵盖了所有用于提高或控制生育的方法，包括但不限于通过外源性激素处理诱导发情、精液采集和冷冻保存、卵母细胞收集和冷冻保存、体外受精（IVF）或单精子卵细胞质内注射（ICSI）、人工授精和胚胎移植（ET）等。近几十年来，家猫的辅助生殖技术不断被开发和优化。除了满足猫主人的需求，这些技术在科学研究领域也至关重要。家猫不仅是为野生或濒危种群开发保种、繁育方法的理想动物模型，在历史上，也是人类生理和疾病生物医学研究的常用模型。据孟德尔动物遗传网站对遗传性疾病和基因型的分类，家猫拥有超过200个遗传特征或疾病，可作为人类疾病的潜在模型。精确控制家猫繁殖能力，有助于减少研究所需动物数量，加快对猫和人类共患疾病病因的了解及治疗方法的制定。本章将探讨家猫关键辅助生殖技术的现状，包括保种技术（卵母细胞、胚胎、卵巢／睾丸组织采集、保存和培养）和胚胎生产技术（体外受精、ICSI和克隆）。

基因组保种技术

若有遗传价值的动物在成功繁殖前死亡，或因身体、行为障碍无法产生后代，保留其品种的遗传潜力就显得尤为重要，以便后续将该品种重新引入种群。例如，利用解冻的家猫附睾精子可使母猫受孕。Toyonaga等（2011）的研究报告指出，通过宫内授精方式，使用从冷冻保存附睾中采集的解冻精子，受孕率可达80％。虽然尚无野生猫科动物死后回收冷冻保存精子授精成功受孕的报道，但Howard等（2015）利用20多年前从濒危黑足雪貂采集冻存的精子，实现了母体受孕，这证明了精液采集和保存对基因品种繁衍的重要价值。第23章介绍了雄性配子的保存方法，第3章介绍了猫科动物的诱导发情。本章重点阐述卵母细胞、卵巢组织和睾丸组织的保存方法，并概述目前临床或实验中实施保种技术所需的常规设备和用品（见表27.1）。

表 27.1 基因组保种和保存工作所需的一般设备和用品

注：1. Goodrowe et al. (1988); 2. Pope (2004);3. Crosier et al. (2020);4. Thuwanut and Chatdarong (2012):5. Lima et al.(2017);6.Lima et al.(2018)。

卵母细胞

在小于20日龄的幼猫卵巢上就能观察到有腔卵泡，且从100 – 120日龄猫体内收集培养的卵母细胞，经体外受精和培养可成功发育至囊胚阶段，尽管其比率低于从成熟猫体内采集的卵母细胞（分别为13.3％和31.8%），但这表明大多数年龄段的猫体内均可获得发育良好的卵母细胞。从卵巢（如绝育摘除或死亡动物的卵巢）收集卵子的过程较为简单，在充满收集液的培养皿中，用手术刀浅切卵巢表面，并在解剖／立体显微镜下寻找从卵泡中释放的卵母细胞。质量较好的卵母细胞通常直径为100 – 115μm，颜色均匀且深，呈圆形，周围覆盖着几层卵丘细胞。

卵母细胞也可借助腹腔镜从有腔卵泡中抽吸采集。该技术的详细方法已有文献发表。简单来说，在卵巢解剖位置上方固定套管，将连接硅胶管的20G大小抽吸针穿过套管到达卵巢部位，穿刺后依靠专用真空泵提供的75mmHg负压，可将直径在2 – 4mm卵泡内的卵母细胞抽吸出来。供体母猫通常需要外源性FSH和促黄体生成激素刺激，以确保最佳手术时机和卵母细胞数量。虽然熟练操作下手术风险很低，但仍可能因附近器官损伤、粘连以及麻醉和对卵巢的刺激引发并发症。若时机和操作得当，通过腹腔镜抽吸可从家猫体内无创获取高质量、成熟的卵母细胞。

猫卵母细胞成功冷冻保存面临挑战，因其高表面积／体积比，卵子体积大，冻存时防止胞内水分形成冰晶困难。而且，与某些其他物种（如人类、小鼠）相比，家猫卵细胞内脂质含量较高，对低温冷冻的敏感性增加。在寻找最适冷冻保护剂浓度、降温时间，特别是冷却速率方面，已开展了大量工作，目前该领域研究主要集中在微量玻璃化冷冻上。玻璃化冷冻与慢速或控制速率冷冻相反，需对样本进行超快速冷却，使其立即转变为“玻璃体”状态，而非冻结，降低形成冰晶损伤细胞的可能性。微量玻璃化冷冻通常将卵母细胞或胚胎装入特定装置，如开放或密闭的超薄吸管（如CryoTip, Irvine Scientific，美国）、纳米环（如CryoLoopT, Hampton Research，美国）或窄条薄膜（如CryoTop T, Kitazato，日本），将卵母细胞置于微量玻璃化冷冻液中，再将载体装置插入液氮中实现玻璃化冷冻。已有文献介绍了猫卵母细胞采集和微量玻璃化冷冻的可视化操作，同时也详细回顾了2006年之前关于猫卵母细胞冻存的工作。

玻璃化冷冻的猫卵母细胞升温解冻并体外成熟后，通过ICSI可生产活体后代。在Pope等（2012）的研究中，利用玻璃化冷冻的猫卵母细胞经体外成熟和ICSI获得30个受精卵，将其中4个2 – 细胞胚胎移植后，产下4只后代（2只代孕母猫），即通过体外成熟 – 玻璃化冷冻 – ICSI过程获得后代的成功率为11.7%。同时，移植体内成熟后的玻璃化冷冻卵母细胞获得的9个ICSI早期胚胎移植后未获得后代。尽管存在明显差异，Sowináska等（2020）比较了体外成熟前后玻璃化冷冻的猫卵母细胞的发育能力，却发现ICSI后各组之间的胚胎发育没有差异。对部分极化（脂质聚集到配子一侧）的猫卵母细胞解冻并进行体外成熟和体外受精，同样也能获得后代。在这项研究中，一只幼崽由35个2 – 6 – 细胞胚胎移植到2只代孕母猫中（2.8%）产生，另外4只幼崽由39个非极化的卵母细胞通过ICSI产生的受精卵（10.2%）移植后生产。

为提高繁殖效率，过去十年研究主要聚焦于改进玻璃化冷冻方法和评估体外培养卵母细胞的发育能力。已有报道显示，用各种玻璃化冷冻方法保存的卵母细胞解冻和受精后，最终发育到囊胚阶段的概率为0% – 30.2%（见表27.2）。

表 27.2 卵母细胞冷冻保存／玻璃化冷冻方法及其成功率参考表

注：使用冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、1.2 – 丙二醇 \((PrOH\) ）和丙二醇（PG)，成功率代表不同处理条件下，发育到不同阶段的卵母细胞数量占总卵母细胞数量的比例。1.Apparicio et al. (2013);2. Mikolajewska et al.(2012)；3. Snoeck et al. (2018);4. Comizzoli et al. (2009);5. Cocchia et al. (2010);6. FernandezGonzalez and Jewgenow (2017);7.de Almeida Monteiro Melo Ferraz et al. (2020); 8. Colombo et al. (2019);9. Sowmáska et al. (2020); 10.Merlo et al.(2008);11. Tharasanit et al. (2011); 12. Nowak et al. (2020);13.Pope et al. (2012);14. Galiguis et al. (2014)。a 玻璃化冷冻冻存产品专利。b 不是所有的玻璃化冷冻卵母细胞解冻后都被用于 ICSI。

胚胎

1988年，首次将家猫体内采集的囊胚期胚胎解冻后移植入受体母猫并获得后代。在该研究中，通过剖腹手术冲胚方式获得139枚新鲜胚胎，利用含有甘油的DPBS慢速冷冻保存，解冻并短时间孵育使其恢复正常生理状态，共有116个囊胚被转移到受孕母猫子宫中，最终获得17只后代，产活胎率为14.7％。Gómez等（2003）利用体外受精后冷冻4 – 5d的胚胎移植也获得活胎，该研究共移植122个第4 – 5天胚胎（桑椹胚时期，通过体外成熟／体外受精生产），最终产下2只后代，产活胎率为1.7％。另外，将缓慢冷冻保存的睾丸组织中的精子通过ICSI注入卵母细胞后获得的209枚胚胎移植入受体母猫中，最终产下2只后代（产活胎率约为1%）。可见，采用的体外操作和步骤越复杂，产生存活后代的难度越高。近年来，研究更注重优化解冻／体外培养后的胚胎存活率（见表27.3），包括评估胚胎（2 – 8个细胞的胚胎）在体外发育到囊胚阶段的能力，或在体外培养胚胎的囊胚腔（如果是囊胚）在体外重新扩张的能力。研究结果表明，不同发育阶段的胚胎解冻后存活率为70% – 80%（见表27.3）；无论缓慢冷冻还是玻璃化冷冻，复苏的2 – 8 – 细胞的胚胎在体外发育到囊胚阶段的能力都降低（13% – 53%）。

表 27.3 胚胎冷冻保存／玻璃化冷冻方法及其成功率参考表

注：冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、1.2 – 丙二醇 PrOH ）和丙二醇（PG）的成功率。成功率代表不同处理条件下，发育到不同阶段的胚胎数量占总胚胎数量的比例。1. Mokrousova et al. (2020); 2. Tharasanti et al. (2012)；3. Pedersen et al. (2008); 4. Gómez et al. (2003);5. Ochota et al. (2017);6. Tsujioka et al.(2008)。a 不是所有的冷冻胚胎都进行培养。

卵巢和睾丸组织

如前所述，从冷冻保存的睾丸组织中采集的精液可用于繁殖后代。但本节重点是保存初情期前的睾丸组织，因为新鲜组织中没有成熟精子细胞。目前，尚未有从家猫冷冻保存或玻璃化冷冻冻存的未成熟卵巢或睾丸组织产生活的后代的相关报道。虽然对玻璃化冷冻、针浸玻璃化冷冻、缓慢冷冻和两步冷冻方案进行了评估，但该领域研究十分有限。

在玻璃化冷冻过程中，组织块先在平衡液和玻璃化冷冻液中孵育，然后直接置于液氮中，并转移到冻存管中储存。使用EG、DMSO和海藻糖作为低温保护剂，将猫卵巢组织置于开放的固体表面和封闭的不锈钢圆柱形凹槽中进行玻璃化冷冻处理。在该研究中，固体表面玻璃化冷冻（SSV）的卵巢组织升温解冻并体外培养7d后，有19%的卵泡保持正常形态。

针浸玻璃化冷冻法是将卵巢或睾丸组织块固定在30G针头上，并连续浸入平衡液和玻璃化冷冻溶液中，用无菌吸纸除去多余的玻璃化冷冻溶液后，将带组织的针头直接插入液氮中，然后将样本转移到预冷的低温瓶中进行储存。与37℃解冻相比，玻璃化冷冻睾丸组织50℃加热5s的生精小管结构、体细胞和生殖细胞存活力以及细胞功能（线粒体膜电位和生殖细胞发育情况）更好。针浸玻璃化冷冻卵巢组织解冻并经过7d的体外培养后，约20%的卵泡保持正常形态。与卵母细胞和胚胎的冻存方法研究一样，猫的性腺组织冻存也进行了缓慢冷冻和玻璃化冷冻两种方法的比较。Tanpradit等（2015）报道了一种缓慢冷冻方法，将组织置于冷冻容器中，使其以 – 1℃/min的降温速度降至 – 80℃，过夜，然后再置于液氮中冻存，这种方法相较于开放式玻璃化冷冻法在保持正常卵泡结构、功能方面更优。

两步冷冻法是将组织块放在预冷冻存管管壁上，然后将冻存管放在液氮蒸汽上方（液面上方4cm）10min，最后浸入液氮中。组织的复苏是将冻存管取出后室温下静置30s后再将组织取出并在室温条件下融化。尽管大多数方法能够保证细胞存活率超过50%，但除实验小鼠外，体外条件下还不能满足精子的发生。

组织基因组保种的未来展望

对于保存的睾丸和卵巢组织的利用仍然十分有限。未成熟／初情期前的猫睾丸组织可移植到免疫缺陷小鼠体内，促进精子发生和成熟。类似地，将冷冻保存的猫卵巢皮质组织移植到免疫缺陷小鼠体内后，发现卵巢上存在有腔卵泡发育。尽管这两种类型的实验结果让性腺组织的利用成为可能，但这种在体实验系统对专门的实验基础设施要求较高，因为免疫缺陷啮齿动物模型需要特殊的饲养管理。

除在体实验外，另一种选择是体外培养。在小型哺乳动物（如实验小鼠）中，睾丸和卵巢组织，或从未成熟动物体内分离出的卵泡通过体外培养和体外受精可获得成熟的受精卵。然而，这些技术尚未用于家猫。用新鲜的小鼠睾丸组织在琼脂糖凝胶培养液上培养，可体外产生成熟精子。将类似的培养体系应用于家猫睾丸组织，经过6周的体外培养后仍有一些生殖细胞存活，但并未出现分化迹象。我们仍需更多的研究来了解猫体外精子发生的条件。大型哺乳动物初情期前的卵巢组织也未能培养出可受精的成熟卵母细胞，这可能是因为在大型哺乳动物中，卵泡从最原始的阶段发育到排卵前的状态需要经历长时间的生长，猫、牛和人类等物种需要约100d，而实验室小鼠等小型哺乳动物仅需要约20d。此外，相较于小鼠卵泡的大小（0.5mm），大型哺乳动物的卵泡会从直径约40μm的原始卵泡生长至排卵前大小超过3mm的成熟卵泡。猫卵泡在发育过程中几乎增大了100倍，其生理状态、激素水平和营养需求都发生了巨大改变，这在体外很难模拟。

为应对这些挑战，最近的研究集中在开发更“仿生”的培养系统上。例如，生物反应器和微流控芯片培养方法的应用，在这种培养体系中，培养液在组织培养板中流动，从而更好地模拟组织通过体内循环对营养物质和代谢产物的吸收、排出和交换。应用这项技术足以使雄性支撑6个月的体外培养并促使精子体外成熟，同时，在该培养系统中发育的精子能够成功繁殖后代。然而到目前为止，还没有将类似的技术应用于家猫睾丸组织培养的报道。在雌性中，相关实验室已经开发了用于体外培养家猫卵巢组织和分离卵泡的微流控卵巢模型芯片，这种动态培养方法相当于短期培养的金标琼脂糖凝胶系统，目前正在猫和其他大型哺乳动物模型中试验，进行进一步优化和改进后才能用于卵泡的体外成熟。

胚胎生产技术

本节从辅助生殖技术难度最低的方法开始介绍并依次展开讨论。表27.4中总结了这些技术需要的一些专用实验室设备和耗材。

卵母细胞体外成熟、体外受精和ICSI等

从卵巢组织的未成熟卵泡中收集的卵母细胞受精前需在体外培养成熟。卵母细胞体外成熟是将数枚卵母细胞（周围附着卵丘细胞）在含有充足蛋白质（如牛血清白蛋白）并添加FSH、促黄体激素或eCG、hCG的成熟培养液（通常为TCM199)，在37 – 38℃和5%CO2条件下孵育24 – 36h，使卵母细胞恢复减数分裂并达到可受精的第二次减数分裂中期的过程。利用家猫体内或体外成熟的卵母细胞，通过体外受精技术和单精子卵细胞质内注射技术已成功繁殖后代。家猫体外受精是将成熟卵母细胞与精子在37 – 38℃、5%CO2的条件下共同孵育24h完成的。2 – 细胞胚胎的体外发育率取决于所选的卵母细胞冷冻保存方法、收集卵母细胞的季节、动物所处的繁殖阶段。实际上，只要配子充分接触并有适宜的培养箱，猫的体外成熟／体外受精和胚胎培养很容易成功（见表27.4)。ICSI是将精子通过显微操作直接注入卵母细胞中。通过ICSI获得2 – 细胞胚胎的效率为30% – 80%。通过ICSI获得的胚胎移植入受孕母体后的产活胎率为1% – 11%。这里要指出的是，这些生产效率的差异可能是由于包括精子和卵母细胞的处理（冷冻保存vs常温）以及移植不同发育阶段胚胎（受精卵vs桑椹胚）等因素造成的，此外，这些过程的实施需要技术人员熟练的操作和专业的显微操作设备（见表27.4）。

表 27.4 体外培养和胚胎生产技术所需的一般设备和用品

注：前几行列出的设备和用品在之后几行也都是必须的。

克隆，也称为体细胞核移植（SCNT)，它是将体细胞核转移到去核的卵母细胞中，然后激活使其恢复发育。与人工授精、体外受精及胚胎移植不同，通过克隆生产的后代存活率低于1％。这种方法需要更复杂的基础设备和大量的实验以确保成功。尽管越来越多的动物主人对克隆他们的猫感兴趣，但仍有一些伦理问题需要考虑。首先，克隆动物不是凭空产生的，它需要一个或多个代孕母亲在特定的发情时间接受卵巢刺激，然后进行胚胎移植。代孕母亲的来源、健康状况和最终命运都必须考虑在内。其次，应该告知动物主人，克隆的后代与供体动物表现出的行为和身体特征（皮毛颜色、图案花纹）并不完全一致。最后，由于上述因素，应当鼓励主人收养，而不是追求克隆。但如果动物主人要求克隆他们的猫，将其推荐给提供此项服务的专业医院／实验室可能会得到最理想的结果。

尽管如此，克隆仍然是一项具有应用价值和潜力的技术。克隆猫通常用于新治疗方案的相关研究，它们之间基因型差异很小，这就类似于同品系实验小鼠所具备的优势。此外，克隆（以及转基因，这部分超出了本章的范围，读者可以参见Asfaw和Assefa在2019年发表的文章）可以被用来增加特定生物医学研究模型猫的数量。如前所述，家猫共有200多种遗传特征／疾病，这些是人类疾病的潜在模型，但是，获得足够数量的样本用以深入研究罕见疾病的治疗方案是一项挑战，生产特定遗传特征的猫群比每窝仅产下1 – 2个性状一致的个体更有助于提高研究效率，同时也减少研究中不需要的繁殖群体数量。

结论

家猫辅助生殖技术的开发和应用已取得重大进展，这些成果源于学术研究和临床实验。尽管如此，家猫通过辅助生殖技术获得后代的总体成功率仍然很低，还需更多研究来改进这些技术。个体对激素刺激反应的差异是提高妊娠率的主要挑战。人工授精的非手术和腹腔镜方法都已得到良好发展。然而，腹腔镜方法需要先进的仪器和系统的操作培训。猫科动物的体外胚胎发育也取得突破，但通过胚胎移植实现妊娠仍存在高度不稳定性，需进一步研究改进。卵母细胞和性腺组织的体外培养系统等更尖端的技术正在家猫中进行不同尝试。在具备兽医从业背景的前提下，兽医们可为动物主人提供各种保种技术来保存动物的遗传和繁殖潜力，但人们也应考虑这些技术的利弊，特别是在每年有数千只幼猫和成年猫可供收养的情况下，仍要谨慎对待家猫的过度繁殖问题。