引言
众多辅助生殖技术可用于猫的基因库建设，既能增加野生猫科动物种群数量，也可对家养／野生猫科动物种群数量进行调控。这些技术多聚焦于利用绝育手术中的活体动物或生殖组织。但在临床实践中，许多家猫可能因潜在疾病或其他并发症死亡，此时主人可选择收集并储存猫的种质资源。
已有从公猫附睾收集精子和（或）冷冻保存存活精子，并用于其他辅助生殖技术繁殖后代的详细报道。在稀有和濒危野生猫科动物生殖管理中，常利用去势或动物死亡后的附睾精子进行个体恢复与繁殖。从附睾成功收集存活精子，主要需考虑性成熟、去势或死亡后的时间以及储存条件等因素。本章将探讨家猫附睾精子的回收方法、储存要求、保存现状及应用。
附睾基础生物学
附睾在精子从睾丸网转运至附睾尾储存的过程中，促使精子逐步成熟。精子通过附睾的平均转运时间（10 – 12天）与其他物种相近。附睾由单一弯曲导管构成，精子依靠蠕动运输。尽管附睾功能区域更为复杂，但大体解剖特征是确定用于保存或辅助生殖技术的附睾精子成熟阶段最具临床意义的方法。附睾在解剖学上分为附睾头（头）、附睾体（体）和附睾尾（尾），这也是精子从睾丸网到输精管的必经路线。在转运过程中，精子发生诸多结构和功能变化：顶体成熟，多数精子在附睾头时顶体异常，到附睾尾时顶体正常；精子获得活力；细胞质液滴从精子中部近端位置迁移至远端位置，该过程发生在猫附睾头体过渡区域，射精会导致多数远端液滴丢失，所以附睾尾的精子倾向于保留远端细胞质液滴。重要的是，尽管来自睾丸的精子能够通过胞浆内精子注射使卵母细胞受精，但从附睾头收集的精子因无或低进行性运动，无法在标准体外受精（试管婴儿）或人工授精后使卵母细胞受精。相比之下，从附睾尾收集的精子与射精的精子在人工授精后受精率相似。
睾丸的收集、储存和运输
大多数6月龄的公猫适宜收集附睾精子。为最大程度获取高质量活动精子，需在动物死亡24小时内采集生殖腺，并将组织储存于4℃环境。同样关键的是，切除的性腺要用无菌生理盐水或其他规定的组织培养液保持湿润，且在4℃冷藏不超过24小时。由于季节对公猫精子产量和质量无影响，成年公猫一年四季均可获取存活精子。然而，当动物因传染病死亡或被安乐死时，需谨慎考虑是否收集和储存精子以备后续使用。
公猫睾丸切除
若需长途运输至实验室，可对活公猫进行常规闭式手术去势，或对死亡动物进行带阴囊的睾丸切除。切除前，结扎离睾丸最近一侧的输精管，并切除一长段输精管。
若睾丸不在采集地点处理，将每个睾丸包裹在盐水浸泡的无菌纱布中（结扎输精管防止精子丢失），放入样本袋，置于装有冷冻冰袋的泡沫塑料冷却器中运输。在睾丸和冰袋间放置纸巾，避免直接接触。此外，睾丸也可装在冷藏马或犬精子的容器中。
实验室附睾精子采集流程
睾丸和附睾解剖
- 解剖睾丸白膜，小心暴露睾丸和附睾。通过解剖睾丸韧带将附睾尾与睾丸分离。
- 分离附睾尾和附睾体，同时保持输精管与附睾尾相连。
- 运用显微解剖仪器，在不切开附睾组织的前提下，切除尽可能多的附睾尾部血管。用毛巾或无菌纱布轻轻吸干组织上的血迹。
- 将附睾尾和输精管放入含有精子收集液的培养皿中。
精子采集
- 可通过以下两种方法从输精管中采集精子：
- 逆行冲洗：使用钝头25G或结核菌素针和注射器，将精子收集液注入输精管切割端，冲洗出附睾尾部精子。若以温和压力无法使液体流经附睾，可连续切割尾部，直至精子流出进入收集盘。
- 顺行冲洗：先用止血器夹住毗邻附睾尾的输精管，将25G或结核菌素针插入输精管腔内，从开口端将精子收集液冲入输精管。采用顺行法从输精管回收的精子，可单独冷冻，也可与附睾尾精子一同冷冻保存。
- 将附睾尾置于预热的精子采集培养液中，用手术刀在附睾尾上多次切开，使精子释放到采集培养液中。操作时要避免切开其他血管，以减少血细胞污染，同时注意不要过度用力切割组织，防止收集的精子中混入组织块。
- 最好在温暖环境下将解剖／浸泡的附睾尾孵育5分钟，使精子扩散到预热（37℃）的收集液中，期间定期轻轻搅动组织。
- 从培养皿中取出组织，将精子收集液和精子混合物转移到无菌微离心管中。在取出组织前，用收集液冲洗组织。
精子收集液的选择
- M199(HEPES改良）培养液。
- Hams F – 10培养液。
- 不含甘油的Trs缓冲液。
- Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水。
- 试验蛋黄缓冲液制冷剂（TYB;Irvine Scientific）或在室内配制冷冻剂 – 不含甘油的两步冷冻剂的A部分。
附睾精子的冷冻保存
在猫科动物中，最常见的冷冻保存方案是“两步法”。第一步在无冷冻保护剂的培养液中稀释冷却精子，第二步加入冷冻保护剂（如甘油）后用液氮冷冻。在家猫精子冷冻保存中，常使用试验蛋黄缓冲液（TYB），该培养液可从商业公司购买，也可在临床或实验室制备改良类似产品。此外，还可采用超快速冷冻方法，用大豆卵磷脂培养液冷冻少量猫附睾精子进行长期存储。
精子冷冻液的配方
商业化TYB（欧文科技）
TYB冷冻剂（含12％甘油）和TYB制冷剂（含0％甘油）以2:1比例混合，得到8％甘油浓度。冷冻保存时，在精悬液中加入预冷的含8％甘油的TYB，比例为1:1，使甘油终浓度达4％。
自制TEST缓冲液，含有7.5%(v/v）甘油和15%(v/v）蛋黄水溶性部分
- 每1000mL水中加入48.3g TES:N tris（羟甲基）（甲基 – 2 – 氨基乙烷）磺酸、11.6g tris（羟甲基氨基甲烷）和2g果糖，制备TES – tris缓冲液。缓冲液渗透压应为325mOsm/kg，pH = 7.1 – 7.2。
- 在TES – Tris缓冲液中加入15%（v/v）的蛋黄水溶性部分。
- 在TES – Tris蛋黄液中加入甘油（7.5% v/v）。
超快速冷冻液
- 超快冷冻液：含0.2mol/L蔗糖的大豆卵磷脂基培养液。
- 大豆卵磷脂培养液：TES – Tris原液缓冲液（TES74g/L和Tris HCI 39.68g/L）滴定至pH7.3（TEST）。然后，将480mL TEST加入到300mL柠檬酸钠溶液（33.84g/L）和220mL双蒸馏水中，随后添加果糖（14g）、大豆卵磷脂（10g）、硫酸链霉素（0.05g）和青霉素 – G(100kIU）。调整pH至7.0，2900xg离心15分钟，上清液经0.8μm和0.4μm过滤器过滤。
精子冷冻程序
两步慢速冷冻（冷冻保存）法
- 用300xg离心8分钟回收／冲洗稀释的附睾精子，去除上清液。
- 缓慢加入TYB制冷剂（不含甘油）重悬精子，使最终精子浓度达到每毫升4000万至6000万精子。
- 将重悬的精子放入10mL或15mL无菌试管中，室温（约22℃）下将无菌试管放入装有500mL水的容器中，再将水容器放入冰箱冷却至4℃，约需3小时。
- 用预冷（4℃）含有8％甘油的TYB冷冻剂在4℃下缓慢1:1稀释精子溶液（稀释后，冷冻保护剂的终浓度为4% v/v甘油）。
- 让稀释后的精子在4℃下平衡15分钟，随后将精子装入预冷（4℃）的0.25mL塑料细管中并密封。
- 所有细管做好标签，至少包含动物名称、品种和收集日期等信息。可使用液氮安全细管标签或用记号笔手工标注。
- 用移液器将精液装入（0.25mL）吸管，使用热封胶或聚乙烯醇粉末密封开口端。
- 将细管放在架子上，放置在距离液氮表面7.5cm的冷却器中1分钟，然后在距离液氮表面2.5cm处再放置1分钟。
- 将细管插入液氮中，并将吸管长期储存在液氮罐中。
超快冷冻（玻璃化）法
- 按上述方法收集精子。
- 将精子悬液转移至无菌微离心管中，离心（300×g；8分钟）使精子沉淀。
- 用冷冻液重悬精子沉淀（1:3v/v）。
- 在室温下平衡5分钟。
- 直接吸取30μL精子悬浮液注入含液氮的桶中。
- 使用长钳，将精子颗粒转移到预先标记的冷冻瓶中，并将冷冻瓶储存在液氮中。
解冻／复温程序
解冻（适用于慢速冷冻保存的样本）
- 用预冷（末端放置于液氮中）的镊子将细管从液氮中取出，立即将细管转移到37℃的水浴中，快速搅动30秒。
- 用1mL预热（37℃）不含冷冻保护剂的Tris蛋黄稀释液缓慢稀释解冻的精液。或者用指定的培养液缓慢稀释解冻的精子悬浮液。
玻璃化精子颗粒的解冻
- 将冷冻瓶从存储液氮罐中取出，保存在液氮中。
- 打开冷冻瓶，将精子冷冻颗粒转移到液氮中。
- 使用预冷冻的金属钳，将单个颗粒转移到含有0.1mL猫优化培养液（FOCM;Herrick et al.,2007)的试管中，同时将试管放在37℃的水浴中。
- 30秒后，将精子悬浮液转移到无菌的微型离心管中，慢慢加入0.2mL预热的FOCM培养液。
- 以300xg离心5分钟。
- 根据所使用的辅助生殖技术，去除上清液，将精子颗粒重悬于预热的新鲜培养液中。
附睾精子用于繁殖
附睾精子已成功应用于体外受精和人工授精。更多相关信息可参考辅助生殖技术章节。
展望
未来研究方向或不再局限于从新鲜收集的附睾中分离精子，而是对类似卵巢组织块的完整附睾组织进行冷冻保存／玻璃化保存。首先需确定组织解冻后能否分离出存活精子，用于胞浆内精子注射或体外受精，若不能立即处理精子，此方法将节省时间。
实践的角度
“不要”：
- 直接在冰上运输睾丸。
- 将睾丸保存在冷冻室（-20℃）。
“要”：
- 如果将睾丸运送到实验室进行处理，请附上描述动物细节的标签（名称、品种、年龄、健康状况等）。
- 提前联系实验室做好准备，确保睾丸一到实验室就可进行处理。
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