23 猫精子冷冻保存技术研究进展

前言

在繁殖领域，养殖者常要求冷冻保存犬精子，却较少对猫精子提出相同需求，且猫精子冷冻保存程序鲜为人知。犬精子冷冻保存历经多年研究与实践，部分国家已建立精子库。在家猫繁殖中，人工授精应用相对有限，且多局限于新鲜精液。这可能是因难以获取足够数量、解冻后活力高的精子，加之猫人工授精操作难度大，抑制了猫育种者的需求以及兽医工作者对精液冷冻保存技术应用的积极性。然而，随着猫作为重要伴侣动物数量的增加，人们对猫精液采集、评估和冷冻保存的研究兴趣也在不断提升。家猫精液冷冻保存技术的开发应用，不仅有助于家猫的快速育种，对保护野生猫科动物也意义重大。《濒危物种国际贸易公约》显示，现有的37种猫科动物中，36种已濒临灭绝，主要原因是地理隔离和种群收缩引发的近亲繁殖，致使遗传多样性减少、育种性能降低。

人工授精可采用新鲜、冷却以及冷冻保存的精液，其中冷冻保存精液能实现长期储存。1978年首次报道利用冷冻 – 解冻精液使家猫成功妊娠，此后，大量猫科动物精液冷冻方案和人工授精技术相继涌现。体外射精精子和附睾中精子均可用于冷冻保存，还可先冷却睾丸，冲洗附睾和输精管以收集精子后再冷冻。猫精液常用安瓿、细管或颗粒进行冷冻保存。一般而言，冷冻保存方案会影响猫冷冻精液解冻后的运动性、活力、顶体损伤以及受精能力。研究表明，相较于细管，颗粒冷冻猫精液解冻后活力下降76%，所以猫精液更适宜保存在冷冻细管中。在冷冻 – 解冻过程中，诸多因素会影响精子质量，如冷冻保护液成分、冷却速率和冷冻方案等。尤其是冷冻 – 解冻会严重损害精子，降低其受精能力，因此低温损伤是精子冷冻保存的限制因素之一。此外，猫科动物精子畸形率较高，一项研究显示，猫科动物仅73.4%±3.5%的精子形态正常，可通过多次交配弥补精子形态和活力的不足。该研究还发现，冷冻 – 解冻后精子畸形率增加，形态正常的精子比例降至58.7%±3.8%。另有研究表明，附睾中正常精子的百分比从新鲜时的76%±2.0%下降至冷冻 – 解冻后的64%±2.6%。

冷冻稀释液

冷冻稀释液能缓冲精液pH，为精子供能、防止细菌滋生，在冷却、冷冻和解冻过程中保护精子，降低氧化应激损伤。精浆会对猫精子受精能力产生负面影响，操作时，低速离心（300xg）去除精浆可显著延长精子存活时间，采用精子上浮法效果更佳，因其能依据精子活力和结构完整性筛选精子。

目前尚无猫专用商业化冷冻稀释液试剂，基于TRIS的冷冻稀释液广泛用于猫精子冷冻保护。甘油、十二烷基硫酸钠、蛋黄和不同类型的糖按不同比例添加到猫冷冻稀释液中，以提升精子冷冻保存效果，此外，冷冻稀释液还包含抗生素，如硫酸链霉素和（或）青霉素G钾等。

研究显示，含20％蛋黄和8％甘油的TRIS冷冻稀释液可显著提高精子解冻后的活力和顶体完整性。大豆卵磷脂具有与蛋黄中低密度脂蛋白类似的冷冻保护作用，目前，含植物源蛋白的冷冻稀释液已广泛应用于灵长类动物、奶牛、绵羊和犬精子的冷冻保存，解冻后精子质量等于或高于传统添加蛋黄的保护剂。特别是大豆中的成分，可显著提高家猫精子冷冻 – 解冻后的活力和获能能力，维持受精能力。

甘油常作为冷冻保护剂加入精子冷冻稀释液，其通过增加精子冷冻过程中未冻结水的比例，降低水结晶对精子的损伤。但甘油的渗透作用会影响精子细胞膜完整性，猫精子对高浓度甘油尤为敏感，冷冻时应使用低浓度甘油。可能会观察到精子运动能力下降，主要原因包括精子尾部离子主动运输和渗透压变化、能量可用性改变以及轴突元件损伤。精子冷冻保存液中甘油终浓度为3% – 8%，常用浓度为4% – 5%。为使甘油终浓度达5%，可在稀释的两个步骤中分别加入不同浓度的甘油（3％和7%），或者将其添加到仅用于第二步稀释的冷冻稀释液中（即第一步和第二步的冷冻稀释液分别含0％和10％的甘油）。添加甘油时的温度也影响解冻后精子质量，甘油可在室温条件下添加，或在4 – 5℃（冷却后）条件下完全或部分添加，以降低其细胞毒性。

此外，哺乳动物精子冷冻保护剂需优化能量消耗，增强精子尾部收缩力，确保解冻后精子具有足够运动性。糖类常作为外源性能量底物、渗透成分和冷冻保护剂添加到精子冷冻稀释液中。但糖浓度过高会抑制精子能量获取，所以冷冻稀释液中需保持适宜糖浓度。虽然多数单糖可用于冷冻保存，但不同单糖代谢可能存在差异。果糖和葡萄糖是体外射精精子的主要能量来源，存在于多种动物精浆中，然而哺乳动物（包括家猫）精浆中不含单糖。研究表明，这些物种的精子通过吸收雌性生殖道内单糖类物质改变自身运动模式。猫精子冷冻稀释液中常添加果糖和葡萄糖，添加糖的类型对冷冻 – 解冻后猫精子形态和活力似乎无影响。

十二烷基硫酸钠（SDS），商业产品Orvus Es Paste（OEP）和Equex – STM的活性化合物成分，是一种水溶性阴离子表面活性剂，常添加到家猫和其他哺乳动物精子冷冻稀释液中。SDS通过修饰冷冻稀释液中的蛋黄脂蛋白，保护精子在冷冻 – 解冻过程中免受毒性作用，增强精子抗冻性和解冻后精子质量。在猫精子冷冻保存中，OEP和Equex – STM终浓度通常为0.5% – 1%，能够改善冷冻 – 解冻后的精子活力。虽添加Equex – STM未显著提高精子冷冻 – 解冻后的活力，但对附睾精子顶体有保护作用。据报道，体外孵育对精子质膜和活力有负面影响，表明短暂的冷冻前暴露有更明显的保护作用。添加0.5％的Equex – STM显著提高了猫附睾精子和电刺激采集精子的冷冻保存效果。此外，研究发现，在5℃冷却前，向用于第二次稀释的冷冻稀释液中添加Equex – STM不影响冷冻 – 解冻后的精子受精能力。

抗氧化剂在猫精液冷冻稀释液中的应用及其对精子质量的影响尚无明确结论。研究显示，添加10U/mL谷胱甘肽过氧化物酶的TRIS – 蛋黄液（TEY）对猫附睾精子解冻后活力有积极作用，但使用200U/mL过氧化氢酶或600U/mL超氧化物歧化酶与未添加的冷冻稀释液相比，未改善解冻后的精子活力和顶体完整性。同样，冷冻稀释液中添加400U/mL过氧化氢酶或超氧化物歧化酶均未改善冷冻 – 解冻后精子的运动性、活力或顶体完整性。

据报道，抗氧化剂DL – 半胱氨酸（改善解冻后精子活力和DNA完整性）和水溶性维生素E类似物（Trolox)（改善解冻后精子活力、直线运动性和质膜完整性），其中任何一种（5mmol/L）添加到TEY – 乳糖冷冻稀释液中，对冷冻 – 解冻后猫附睾精子具有保护作用。此外，在TEY – 葡萄糖冷冻稀释液中添加25mmol/L左旋肉碱，在解冻后的2h内可显著改善猫附睾精子的活力。

其他添加剂也用于猫精子冷冻稀释液。例如，牛磺酸是一种含硫氨基酸，在精子渗透压调节中起关键作用，能提高精子活力。研究显示，在TEY – 葡萄糖冷冻稀释液中添加25 – 50mmol/L牛磺酸可调节精子细胞渗透压，显著提高精子解冻后的运动能力。在含有10％蛋黄的脱脂牛奶 – 葡萄糖冷冻稀释液中加入75mmol/L牛磺酸与TEY – 果糖冷冻稀释液同样能维持电射精收集的冷冻 – 解冻后的精子活力和正常形态。

几种植物源性物质在精子冷冻保存中的保护能力也得到广泛评估。研究显示，芦荟中含有类似传统精子冷冻保护剂的物质，其冷冻保护作用已在山羊、牛、犬和野猪精子冷冻保存中得到验证。芦荟的抗氧化、抗菌以及细胞再生等特性，被认为能提高冷冻保存精子解冻后存活率。然而，使用芦荟粗提取物对猫附睾精子冷冻保存效果不佳。

咖啡因、己酮可可碱和2′-脱氧腺苷因作为动力兴奋剂的剂量依赖效应，被用于精子冷冻保存。研究表明，这些物质使冷冻 – 解冻后的猫附睾精子产生过度活跃的运动，运动性能仅比新鲜精液下降约10%。

目前已对基于TEY、蛋黄或脱脂牛奶、脱脂牛奶 – 蛋黄以及基于TRIS添加蛋黄的不同商业化冷冻稀释液对猫精子的冷冻保存效果进行评估。以TEY为基础专门生产的冷冻稀释液通常精子冷冻保存效果更好。由于商品化冷冻稀释液操作便捷、适用品种广泛，有时仍是不错的选择。

冷却速率和技术

从体温冷却至冷冻温度的速率对维持精子完整性和受精能力至关重要。冷冻前，猫精液需在5℃放置约20min。冷休克对精子的损害机制尚不完全明确，可能与细胞膜脂质相变有关，导致相分离，使活生物膜丧失选择性渗透特性。当精子从体温快速冷却至5℃（4℃／min）时，精子内会产生冰晶致细胞膜破裂，将冷却速率降至0.5℃／min时，可最大程度减少精子结构损伤。

温度降至5℃后，将精子分装至细管和安瓿中。继续降温可通过程序化冷冻仪控制，或在浸入液氮前进行液氮熏蒸。液氮熏蒸比程序化冷冻仪操作更经济、快捷，比干冰冷冻更方便。将装有精子的细管水平或垂直放置在液氮表面一段时间，使细管温度从4 – 5℃降至约 – 40℃、 – 100℃、 – 110℃、 – 120℃或 – 130℃后，浸入液氮中。通常，1.5mL精子容量的细管需水平放置熏蒸，0.5mL和0.25mL的细管水平和垂直放置熏蒸均可。据报道，装有精子的细管放置在距离液氮表面4cm、6 cm或7cm的位置均有良好冷冻效果。当装有精子的细管垂直放置于液氮表面熏蒸时，细管通常为0.25mL，在浸入液氮前，将装有细管的罐子表面用液氮熏蒸3次。该技术最早用于犬精子冷冻保存，即将装细管的罐子分别放置在距离液氮表面7cm、13cm和20cm处2min、2min和1 min，之后浸于液氮中。猫精子的垂直低温保存也可使用专门的真空瓶（杜瓦瓶）。0.25mL细管置于预冷（5℃）不锈钢圆筒中，放置在高于液氮表面的杜瓦瓶中，以获得特定冷却速率，之后将圆筒浸于液氮中。与快速冷却速率相比，这种缓慢冷却（3.85℃／min）低温保存技术在精子解冻后显示出更高的运动性和顶体完整性。此外，也可进行多步液氮熏蒸冷冻猫精子，即将细管放置距液氮表面7cm处1min，3.5cm处1min，然后浸入液氮中。

也有对猫附睾精子和射精精子使用程序化冷冻仪进行冷冻保存的报道。在低温保存初始阶段，精子冷却速率相对较慢（即 – 1℃／min，从4℃降至 – 1℃或 – 25℃），以减少精子中的冰晶，随后迅速降温（即 – 30℃／min或更大），直到最终温度降至 – 100℃或 – 196℃。随后将冷冻保存的精子转移至液氮罐中长期保存。

也有研究报道，猫附睾精子冷冻保存可缓慢平衡到15℃或10℃，分别经历40min和100min缓慢降温达到该温度，然后将装有精子的细管放置在距液氮表面上方2cm处15min，于 – 167℃时将细管转移至液氮罐中保存。

解冻

与冷冻保存过程一样，解冻过程也会导致精子损伤。解冻时会发生再结晶，形成冰晶致细胞损伤，此外，精子细胞膜会出现渗透梯度，导致精子质膜损伤和细胞死亡。不同冷冻程序往往需要不同解冻速率，以保证最大精子存活率。一般来说，快速冷冻的精子需要快速解冻。研究显示，快速冷冻后，快速复温可限制精子中的水分再结晶。这解释了犬冷冻精子在70℃解冻比在37℃解冻后具有更高精子质量。然而，快速解冻也可能导致精子渗透压突然变化，产生负面影响。虽然缺乏不同解冻速率对猫冷冻精液影响的相关报道，但有研究发现，与37℃解冻1min相比，60℃解冻5s的猫附睾精子畸形率显著降低，顶体完整率显著升高。因大多数诊所水浴锅温度设置为37℃，所以37℃解冻更常用。有研究显示，猫冷冻精液在37℃或70℃下解冻效果一致，但建议解冻后用TRIS缓冲液稀释，以减少冷冻稀释液中某些成分在解冻后对精子产生的毒性作用。

建议方案

作者参考Zambelli等（2002）报道的实验方案，并在2006年进行调整。收集的精液以300xg离心5min，去除多余精浆并浓缩精液。室温（约20℃）下，使用含20％蛋黄的TRIS冷冻稀释液重悬精子。在含20％蛋黄的TRIS冷冻稀释液中添加8％甘油和1%Equex – STM，然后按1:1比例稀释，使精子浓度达到40×10/200μL。将精液装入0.25mL细管中，以0.2℃／s的速率冷却精子至5℃，并在5℃下平衡25min。预冷的0.25mL细管（5℃）放入5℃预冷不锈钢圆筒中，将圆筒置于杜瓦瓶中放于液氮上方（冷却速率维持在3.85℃／min）进行熏蒸。当细管温度降至 – 40℃时将圆筒浸入液氮中保存。解冻时，将细管置于37℃水浴中30s。