18 猫的精液采集、评估及人工授精

引言

在猫的繁殖领域，兽医师常需采集猫的精液用于人工授精或生育能力诊断评估。自1970年人工授精技术首次报道以来，该技术不断发展成熟。随着内镜下宫内授精技术的进步，人工授精取得重要进展。使用新鲜或保存的精子进行人工授精，具有控制疾病、避免繁殖障碍等优势。此外，猫在濒危野生猫科动物保护以及人类疾病研究模型方面具有重要意义。

精液采集过程中，需保证精液质量，同时尽量减少动物应激。目前存在多种精液采集方法，不同方法各有优劣。采集后的精子需及时评估，而精子评估受射精量少等因素限制。

精液采集

假阴道采精法

假阴道采精法（AV）最早于1970年被报道，常用于猫舍或实验室。该方法设备成本低，无需约束猫，一名技术人员即可操作，且可多次采集。动物经过适当训练，在母猫发情期间温和训练2周，即可使用该方法采精。但对于未经训练的单只猫，该方法较难取得理想效果，且需判断母猫发情周期。

简单的假阴道可由塑料管（如离心管）和巴斯德移液管中的橡胶球制作。另一种模型使用5mL塑料管、彭罗斯引流管和小玻璃管制作，使用时管中装满40℃的水以维持精子温度。采精前，让公猫接近母猫可增加其性唤起。操作员戴手套将假阴道滑到竖起的阴茎上，经过几次交配动作猫会射精。训练良好的公猫，可在无发情母猫时，爬上操作者受保护的手臂完成采精。第二次射精最快可在10分钟后收集，但频繁采集会影响精子质量，每周采集3次以内对精子体积和浓度无明显影响，超过4次则参数迅速下降。

电刺激采精法

经直肠电刺激采精法（EE）广泛应用于无法进行假阴道训练的野生动物、动物园饲养动物以及脊髓损伤的人类。该方法首次应用于猫是在1970年。电刺激采精法收集的精液体积通常较大，适用于未经训练、有攻击性或无发情母猫刺激的雄性猫，且已证明该技术安全，不会引起直肠组织学或结肠镜检损伤。

该方法的缺点包括需对患病动物麻醉、操作人员需具备专业技能以及设备投资较大。常用麻醉药物有氯胺酮（20mg/kg，肌内注射），或氯胺酮与美托咪定联合用药（分别为5mg/kg和80μg/kg，肌内注射）。美托咪定添加可产生更高浓度精子，提供良好的药理学约束和足够镇痛作用，且给药后尿道中可观察到高浓度精子，为药理学诱导后导尿采精法奠定基础。若无美托咪定，可使用半剂量的右美托咪定。

电刺激采精法需使用与直肠探头（直径1cm，长度12cm）连接的电射精器，探头配备三个纵向不锈钢电极。诱导麻醉后，需确保直肠无粪便，用盐水湿润纱布清洗阴茎龟头部分。将润滑探头轻轻插入直肠7-8cm，向腹侧推到膀胱颈上。开始电刺激前，收缩包皮暴露龟头并引入无菌离心管。常用电刺激方案由80个刺激组成，分为三组（分别为30个、30个和20个），每组之间休息2-3分钟。刺激过程中，公猫双后肢会僵硬且对称伸展，若后肢伸展异常，可能是电极与直肠黏膜接触不良。

药理学诱导后导尿采精法

药理学诱导后导尿采精法（Ur.Ca.P.I.）是近几十年报道的新方法，可克服假阴道采精法和电刺激采精法的一些缺点。美托咪定或其他α2-肾上腺素能激动剂在其他物种中也有类似效果，如在大鼠体内可使输精管收缩，精子细胞释放到尿道但不射精；在种马中可导致射精，且精子适合冷冻。

该方法无需特定设备和训练，可降低精子采集、评估和使用成本。采集的精子可冷冻保存，用于体外受精或人工授精。其特点是精液体积小但精子浓度高，不过需小心处理以避免损伤精子，且采集的精子质量与附睾切开挤压获得的精子质量相同或更好。

该方法的缺点是采集前需镇静，虽药物剂量在安全范围内且动物耐受性良好，但许多麻醉师因不愿使用高剂量麻醉药而不建议使用。育种对象需选择身体条件良好的动物，麻醉前建议进行心脏学检查。目前有报道使用右美托咪定替代美托咪定用于精子采集。

采精时使用开放式公猫导尿管，当动物达到5级镇静（注射约10-15分钟，依个体反应而定）时进行插管。露出阴茎，将导尿管轻柔缓慢插入尿道9cm，缩回包皮，确保导管尖端不进入膀胱。导管插入后立即取出，利用毛细作用收集精子，避免长时间停留导致尿液污染。该方法可多次采集且能获得高质量精子样本，是精子库采集精子的良好方法，但有1.7%-8%的概率采集失败。

精子评估

精子评估是雄性生育能力诊断评估的重要基础，可提供精子质量、运动性等参数，但精子质量好也不能保证生育能力，且会受采集方法、环境条件等外部因素影响。猫射精量低以及难以保持恒定环境参数是全面评估的最大障碍，临床医生可通过练习使用常规猫睾丸切除术后获得的精子，提高操作和评估少量射精的技能。

根据精子体积和浓度，可能需稀释样本，常用的稀释液有Tris-葡萄糖-柠檬酸盐和酪氨酸-白蛋白-乳酸-丙酮酸盐培养基（TALP）。

宏观参数

精液应呈均匀的乳白色，若样本出现血液（粉红色）、炎症或尿液（有尿液气味），需对动物进行全面检查。可使用可变体积的校准移液管精确评估射精量。

微观参数

为使用更大样本量评估，可在获得初始射精体积后添加稀释剂。精子活力可通过400倍相差显微镜和预热载玻片主观评估，或使用计算机辅助精子分析（CASA）客观评估，评估指标包括总运动（TMOT）率、前进运动（PMOT）率和精子活力指数。

形态学评估可使用相差显微镜，用福尔马林水溶液固定精子后计数，也可通过精子染色评估，如风干染色（瑞氏-吉姆萨染色）、湿染色（伊红-苯胺黑染色）等。固绿FCF-玫瑰红染色可很好区分精子结构。评估时，每个样本在1000倍（油）镜头视野中至少计数100-200个精子，考虑头部、顶体、中段和尾段的形态学异常。

评估精子缺陷的指标有畸形精子症指数（TZI）和精子畸形指数（SDI）。TZI表示每个异常精子的缺陷数量，范围为1-4；SDI是每个精子的平均缺陷数，在人医中，SDI是更可靠的体外受精结果预测指标。

顶体完整性是受精成功的关键因素之一，可用异硫氰酸荧光素（FITC）染色在荧光显微镜下评估。实践中，精子活力和形态可用伊红-苯胺黑染色评估。精子浓度通过在福尔马林水中稀释样本后，在相差显微镜下的血细胞计数板或Bürker计数板中计数测定，确定体积和浓度后可计算精子总数。

精浆、前列腺液和尿道球腺液的渗透压和pH已有报道，但因射精量少，精浆生化特性报道较少。不同采集方法获得的精子特征不同，假阴道采精法收集的精液与自然交配相似，电刺激采精法射精量更大，药理学诱导后导尿采精法精液体积最小。若需进一步诊断，可将精子样本送专门实验室进行透射电子显微镜或荧光显微镜分析。

人工授精精子用量和授精部位

不同精子数量和授精部位的人工授精受孕率不同。阴道内授精时，使用20×10⁶个、40×10⁶个和80×10⁶个新鲜精子的受孕率分别为6.6%、33.3%和77.8%，较高授精数量可能与多次射精收集的精子数量相当。手术将8×10⁶个新鲜精子注入一个子宫角的受孕率为80.0%，阴道内受精所需精子量约是子宫内受精的10倍。

子宫内人工授精使用2.4×10⁶-19.2×10⁶个新鲜精子可受孕。经宫颈子宫授精，使用含10×10⁶个新鲜活动精子和含30×10⁶个冷冻解冻活动精子的溶液，受孕率均为100%。药理学诱导后导尿采精法采集的8.1×10⁶-53.3×10⁶个新鲜精子宫颈内镜人工授精成功，每只母猫授精2次，受孕率100%。

不同剂量的新鲜或冷冻精液的受孕率如下表所示：

注：经宫颈人工授精母猫的受孕率。

注：表中的值表示由几位作者报告的平均值的范围。AV，假阴道采精法；EE，电刺激采精法；Ur.Ca.P.I.，药理学诱导后导尿采精法。